リアルタイムPCRでハウスキーピング遺伝子が増幅しない原因と解決策

リアルタイムPCRの実験でハウスキーピング遺伝子が増幅せず、融解曲線も不安定な場合、いくつかの原因が考えられます。この記事では、考えられる問題点とその解決策について解説します。

ハウスキーピング遺伝子が増幅しない理由

ハウスキーピング遺伝子が増幅しない場合、まず考えられるのはDNAサンプルの品質です。キットで抽出したDNAが不純物を含んでいたり、分解が進んでいる場合、増幅に支障をきたすことがあります。また、PCR反応系におけるプライマーやプローブの設計ミスも原因として挙げられます。

融解曲線がガタガタになり、ピークが見えない場合、サンプル中の不純物やPCR産物が複数存在する可能性があります。例えば、異常な二次構造の形成やプライマー・プローブの相互作用の不具合が考えられます。また、反応温度設定が適切でない場合にも、このような現象が発生することがあります。

まず、DNAの品質を再確認し、必要に応じて再抽出を試みましょう。また、プライマーやプローブの設計を見直し、適切な最適化を行うことが重要です。特に、融解曲線の異常については、反応温度やサンプルの濃度を調整することで改善することがあります。

それでも解決しない場合、リアルタイムPCRの反応系を再構築することが必要かもしれません。例えば、エタノールの残留や他の化学物質が反応系に影響を与えている場合もあるため、洗浄方法や反応系の最適化を再確認することが推奨されます。

リアルタイムPCRの失敗にはさまざまな原因が考えられますが、まずはDNAサンプルの品質やプライマー設計を見直し、反応条件の最適化を行うことが解決への第一歩です。適切な調整を加えることで、問題を解決し、安定した増幅と融解曲線の取得が可能になります。